髓系KLF5基因缺失小鼠腹主动脉瘤形成的生物信息学分析

背景 腹主动脉瘤(AAA)是一种老年常见高死亡率的心血管系统疾病,发病机制不明确,临床上无有效治疗药物.本课题组前期研究发现,KLF5基因在人和小鼠AAA组织中表达升高,但是对于详细的KLF5基因调控炎症相关基因表达的网络分析未见报道.目的利用基因芯片技术对髓系KLF5基因表达缺失(LyKLF5-/-)小鼠AAA的差异表达基因进行生物信息学分析,探讨KLF5基因在AAA中的调控机制.方法 研究时间为2015年1月-2019年4月.将SPF级KLF5-flox小鼠和SPF级LysM-cre小鼠杂交培育的雄性髓系遗传性LyKLF5-/-小鼠与同笼野生型(WT)C57BL/6小鼠各3只作为实验动物.通过CaPO4诱导小鼠AAA模型,并提取肾下腹主动脉组织总RNA行mRNA芯片筛查.对于筛选出的差异表达基因,利用在线数据库Metascape进行GO功能富集分析和KEGG富集分析,再利用STRING在线数据库进行蛋白互作网络分析.结果 mRNA芯片共筛选到上调表达基因646个,下调表达基因1 410个(｜FC｜≥2,P＜O.05).与WT小鼠比较,抑制炎症的基因在LyKe5-/-小鼠表达增加,Bcas3、Hck基因表达分别上调3.96、3.14倍;促进炎症的基因在LyKLF5-/-小鼠表达降低,Retnla、Olig1、Tnfrsf11a分别下调7.68、5.07、3.66倍.GO功能富集分析显示上调差异基因主要参与多肽抗原合成和表达的调控、核苷二磷酸代谢过程、肌节组织的正向调节等过程;下调差异基因主要参与生长发育、细胞对葡萄糖刺激反应的胰岛素分泌调节、平滑肌细胞迁移的正调控等过程.KEGG富集分析显示上调差异基因主要影响破骨细胞分化、吞噬小体、氨基酸的生物合成等通路;下调差异基因主要影响血管平滑肌收缩、泛素介导的蛋白水解作用以及肌动蛋白细胞骨架的调控等通路.蛋白互作网络分析证实,小鼠髓系LyKLF5-/-导致参与血管炎症相关基因Bcas3、Hck表达上调和Retnla、Olig1、Tnfrsf1 1a表达下调.结论 Bcas3、Hck、Retnla、Olig1、Tnfrsf1 1a基因可能是参与血管炎症和AAA形成的重要候选基因.

2020

2021/07/20

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一种可用于溶瘤病毒M1体内组织定量的TaqMan RT-Qpcr检测法的建立与评价

目的:监测溶瘤病毒M1在组织中的传播情况,以更好地控制给药剂量,确保安全性.方法:建立一种基于TaqMan的实时定量PCR检测法,用于对组织中溶瘤病毒M1的检测和定量,并检测静脉注射病毒后多种实验动物体内的病毒载量和分布.结果:我们以一对特异的引物(Q3)和标准RNA开始SYBR Green RT-qPCR研究.通过优化实验方法发现当退火温度高于62℃时可降低基质效应,但却影响了扩增效率.因此我们建立了一步法TaqMan RT-qPCR实验,重新设计了一对Q3短引物(Q3S).运用一步TaqMan RT-qPCR检测法和Q3S引物,在混有SD大鼠或食蟹猴基质RNA的背景下,均能特异性检测到低拷贝数的标准RNA.经验证,该方法适用于检测M1病毒在小鼠、SD大鼠和食蟹猴体内的组织分布.结论:利用Q3S引物构建的TaqMan一步法RT-qPCR能够定量检测不同动物不同组织样品中的M1病毒,具有特异性和敏感性,可进一步应用于临床样品的检测.

2020

2021/07/20

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胶质细胞源性神经营养因子/PI3K/AKT通路参与电针促进面神经压榨损伤模型兔的面神经再生

背景:多穴位电针治疗周围性面瘫的机制不明.胶质细胞源性神经营养因子(glial cel-derived neurotrophic factor,GDNF)是促进体外运动神经元存活的最有效因子,PI3K/AKT信号通路在保护受损神经元方面发挥着重要作用.目前暂没有GDNF/PI3K/AKT通路参与电针促进兔周围面神经再生的研究.目的:观察电针对周围面神经压榨损伤后再生的影响,并从GDNF/PI3K/AKT介导的信号通路角度探讨电针对面神经元的保护机制.方法:成年健康新西兰大白兔由西南医科大学动物实验中心提供,随机分成正常组和模型组.模型组制备右侧面神经颊支压榨性损伤的病理模型,造模成功后随机分为模型对照组和电针组,模型对照组自然康复,电针组取右侧翳风、颊车、四白、地仓、阳白、颧髎穴位进行电针治疗,1次/d,每次30 min.观察动物面瘫症状的改善情况并进行评分;正常组直接取材,模型组分别于术后1,4,7,14,28 d取含面神经元的脑桥组织,进行苏木精-伊红染色观察神经元形态,尼氏染色观察尼氏小体,免疫组化测定GDNF的阳性表达,Western blotting检测3组各时间点面神经元组织中GDNF、PI3K、AKT、P-AKT的蛋白表达.实验方案经西南医科大学动物伦理学委员会批准,批准号为20170120001.结果与结论:①与模型对照组相比,电针组动物的面瘫症状(患侧口角歪斜下垂,触须倒伏且运动减弱,眼睑上抬不能)恢复较快且完全;②电针组面神经元形态学改变、尼氏体变化均较模型对照组病理变化轻;③术后各时间点,面神经元GDNF免疫反应较强,阳性细胞数多于模型对照组(除术后1 d,其余各时间点P<0.001),且面神经元组织中GDNF、PI3K和P-AKT蛋白表达明显增高(P<0.05/0.01/0.001).提示:电针可有效治疗由压榨面神经颊支引起的周围性面瘫,促进面神经元形态恢复,其面神经元保护机制可能与上调GDNF在面神经元中的表达,激活PI3K/AKT信号通路有关.

2020

2021/07/20

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不同时间点静脉移植嗅鞘细胞修复脊髓损伤

背景:嗅鞘细胞具有促进轴突再生、为受伤的宿主细胞提供营养支持以及调节炎症反应的能力,是修复脊髓损伤具有潜力的细胞.目的:探讨通过静脉移植嗅鞘细胞治疗脊髓损伤的最佳移植时间窗.方法:SPF雄性SD大鼠30只,采用脊髓半横断建立大鼠脊髓损伤模型,并随机分为5组:脊髓损伤后注射嗅鞘细胞1 d移植组、3 d移植组、7 d移植组、10 d移植组及PBS对照组.应用荧光量子点标记嗅鞘细胞;分别于1,3,7,10 d时间点通过尾静脉移植应用量子点标记的嗅鞘细胞;PBS对照组脊髓损伤后注射PBS.注射后1 d取损伤处的脊髓;应用小动物成像仪测定不同时间点转移到损伤处荧光的数值,通过荧光的强度衡量转移到损伤处细胞的量;应用嗅鞘细胞Anti-p75 NGF Receptor抗体做损伤处脊髓的免疫组织化学.实验方案经宁夏医科大学动物实验伦理委员会批准(编号:2017-073).结果与结论:①荧光量子点可以标记嗅鞘细胞;②荧光测定结果与免疫组织化学染色结果:1,3,7,10 d时间点通过尾静脉移植的嗅鞘细胞均有细胞转移到损伤处,7 d移植的嗅鞘细胞转移到损伤处的最多;③结果说明,脊髓损伤不同时间点注射的嗅鞘细胞均可以转移到脊髓损伤处,损伤后7 d移植的嗅鞘细胞转移到损伤处的细胞数量最多,可以作为移植的最佳时间窗.

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2021/07/20

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脉冲电磁场磁疗与骨硬化蛋白单克隆抗体联合干预绝经后新西兰大白兔骨代谢和骨微结构的变化

背景:脉冲电磁场与骨硬化蛋白单克隆抗体皆能对绝经后新西兰大白兔骨代谢产生良好影响,但关于两者联合干预的效果至今少有报道.目的:探讨脉冲电磁场联合骨硬化蛋白单克隆抗体对绝经后新西兰大白兔骨代谢的影响,探索其对骨质疏松症的治疗价值.方法:采用卵巢切除法建立新西兰大白兔绝经后骨质疏松动物模型.将实验动物随机分为4组:卵巢切除组、脉冲电磁场组、骨硬化蛋白单克隆抗体组和脉冲电磁场+骨硬化蛋白单克隆抗体组,每组10只.术后第1天起,脉冲电磁场组给予脉冲电磁场磁疗每天1次;骨硬化蛋白单克隆抗体组给予骨硬化蛋白单克隆抗体皮下注射每周2次;脉冲电磁场+骨硬化蛋白单克隆抗体组接受脉冲电磁场磁疗每天1次、每周5次,骨硬化蛋白单克隆抗体皮下注射每周2次;卵巢切除组皮下注射相同剂量的生理盐水每周2次,干预共8周.8周后行骨代谢指标检查、骨密度测定、MicroCT骨微结构参数检测.动物研究中的所有程序经复旦大学实验动物科学部批准(20171263A193).结果 与结论:①卵巢切除6个月新西兰大白兔骨密度显著下降,提示骨质疏松模型建立成功;②与卵巢切除组相比,3个治疗组L3椎体的骨密度均显著增加(P＜0.05);③3个治疗组血清骨特异性碱性磷酸酶水平均显著高于卵巢切除组,血清抗酒石酸酸性磷酸酶5b水平均显著低于卵巢切除组;脉冲电磁场+骨硬化蛋白单克隆抗体组血清抗酒石酸酸性磷酸酶5b的水平明显低于脉冲电磁场组、骨硬化蛋白单克隆抗体组;④脉冲电磁场+骨硬化蛋白单克隆抗体组骨微结构参数(骨体积分数、骨小梁厚度、骨小梁数量、骨小梁分离度)均优于脉冲电磁场组、骨硬化蛋白单克隆抗体组(均P＜ 0.05);⑤骨硬化蛋白单克隆抗体和脉冲电磁场联合治疗可以增强去势新西兰大白兔骨密度,改善骨代谢和骨微结构.

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2021/07/20

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基于网络药理学及分子对接技术探讨沙棘治疗阿尔茨海默病的作用机制Δ

目的:揭示沙棘治疗阿尔茨海默病(AD)的作用机制,为进一步探究沙棘治疗AD的药效物质基础提供理论参考.方法:通过TCMSP、Uniprot、GeneCards等数据库筛选沙棘活性成分、靶点及AD相关靶点基因;采用Cytoscope 3.7.1软件构建化合物-靶点-疾病网络图;通过STRING数据库制作靶点相互作用(PPI)网络,筛选度值较高的沙棘治疗AD的潜在靶点与沙棘活性成分进行分子对接;采用Clue GO插件对沙棘治疗AD的潜在靶点进行GO基因本体(GO)分析、京都基因与基因组百科全书(KEGG)通路富集分析.取50只小鼠随机分为空白组、模型组[D-半乳糖120 mg/(kg·d)及AlCl3溶液20 mg/(mL·d)]、阳性药物组[奥拉西坦260 mg/(kg·d)]、沙棘果油提取物组[1.6 g/(kg·d)]、沙棘多酚提取物组[1.6 g/(kg·d)],每组10只.各组小鼠分别灌胃相应药物的同时灌胃造模剂,空白组灌胃等体积蒸馏水,每天1次,连续给药60 d.通过Morris水迷宫实验测定各组小鼠学习记忆能力,采用酶联免疫吸附(ELISA)法检测小鼠海马体组织免疫因子水平,采用苏木素-伊红染色(HE)法观察海马体的病理学变化,对沙棘治疗AD的作用机制进行初步验证.结果:沙棘22个活性成分(槲皮素、山柰酚、异鼠李素、β-胡萝卜素、β-谷固醇等)可能通过调控丝氨酸/苏氨酸激酶编码蛋白(AKT1)、氨基端激酶(JUN)、丝裂原活化蛋白激酶(MAPK1)等147个靶点影响核受体活性、脂多糖介导的信号通路等生物过程及白细胞介素17(IL-17)信号传导途径、肿瘤坏死因子(TNF)信号传导途径等114条代谢通路.分子对接结果显示,沙棘主要活性成分与主要靶点蛋白结合分值均在4.25以上,具有较好的结合活性.药理学实验结果显示,沙棘提取物能够使AD模型小鼠的逃避潜伏期缩短、穿越平台次数增加,减轻其脑海马体组织损伤,降低其脑海马体组织中炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-17含量.结论:沙棘的活性成分可调控AD发病重要通路中的多个靶点;动物实验初步验证其可通过抑制炎症因子的表达,来减轻AD模型小鼠海马体损伤,改善小鼠学习记忆能力.

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2021/07/20

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羧酸酯酶的种属差异对药物代谢的影响

羧酸酯酶(CES)是人和动物体内含量最丰富的水解酶,参与多种内源性和外源性化合物及药物的代谢过程.由于CES在人和动物体内的分布、活性具有明显的种属差异,这些差异与药物在人和不同种属动物体内的药代特性、药效及毒副作用密切相关,因此,本文就CES的分类、分布、诱导和抑制方面的种属差异,以及在血浆、肝、小肠、皮肤中的种属差异对酯类前药的代谢过程造成的影响进行总结,旨在为新药临床前研究正确选择实验动物提供参考,以准确预测临床药物代谢、药效和毒理作用.

2020

2021/07/20

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不同组织部位诱导膜血管化及成骨因子表达的比较

背景:研究发现在皮下、肌肉等部位植入聚甲基丙烯酸甲酯骨水泥也可形成诱导膜,膜内同样具有微血管的形成并分泌多种成骨因子.目的:比较皮下、肌肉、股骨骨缺损处诱导膜内血管化程度和成骨因子表达的差异.方法:将36只雄性SD大鼠(购自广州中医药大学实验动物中心)随机分为3组,分别在后肢皮下、肌肉内、股骨骨缺损处植入聚甲基丙烯酸甲酯抗生素骨水泥占位器,每组12只.植入6周后,取出骨水泥周围的诱导膜,苏木精-伊红染色观察诱导膜组织形态结构变化,Western Blot印迹方法、RT-qPCR法、免疫组织化学染色法检测诱导膜中骨形态发生蛋白2、转化生长因子β1、血管内皮生长因子的表达情况.实验获得广州中医药大学动物实验伦理委员会批准,批准号:20181101006.结果与结论:①苏木精-伊红染色显示3组均可形成诱导膜,但骨缺损组诱导膜组织切片外层血管数量较肌肉组、皮下组多,靠近骨水泥侧的内层成纤维细胞和肌纤维细胞数量较肌肉组、皮下组多;②免疫组织化学染色显示,骨缺损组骨形态发生蛋白2、转化生长因子β1、血管内皮生长因子阳性表达最多,皮下组最少;③Western Blot与RT-qPCR检测显示,骨缺损组骨形态发生蛋白2、转化生长因子β1、血管内皮生长因子表达均多于肌肉组、皮下组(P<0.001);④结果表明,不同的周围组织条件对诱导膜的组织结构和成骨因子表达有重要影响,在骨缺损处植入聚甲基丙烯酸甲酯骨水泥可提高诱导膜的形成质量,膜内新生血管更丰富,骨生长因子的表达量更多.

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2021/07/20

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自体腹膜移植回肠浆肌扩大原位膀胱的重建

目的 为探求一种理想的肠代膀胱重建的方法,设计并建立腹膜自体移植回肠膀胱重建的小型猪实验动物模型.方法 随机选取封闭饲养的雌性成年实验用小型猪6只,体重28～ 33 kg,在全麻下行回肠浆肌层腔外直接剥离术+膀胱部分切除术+膀胱重建手术(将选取的自体腹膜覆盖于带血供的回肠浆肌层表面制备成复合游离瓣膜,将其与膀胱残垣进行吻合修补重建新膀胱),术后5d拔除双侧输尿管导管,7d拔除气囊支撑尿管,观察排尿情况.术后12周在麻醉下行膀胱造影及尿流动力学检查,之后予安乐处死动物,取出膀胱标本进行常规病理学、免疫组织化学及电镜检查.结果 将6只猪进行手术实验,6只动物术后正常存活,无1只死亡,无腹膜炎、肠梗阻或尿瘘等并发症发生.移植腹膜-回肠浆肌复合游离瓣膜均全部成活,术后拔除尿管观察动物排尿可,黄清,与术前对比无差异.术后膀胱形态及功能与术前比较无差异.病理学显示,术后12周可见重建膀胱部位所覆盖腹膜完全被尿路移行上皮取代,未见回肠上皮细胞再生与残留.扫描电镜观察显示,重建膀胱部分移行上皮完整致密、排列整齐,吻合交界处膀胱黏膜移行细胞连续,无中断及错位.结论 在动物(猪)腔外回肠浆肌剥离与自体腹膜移植替代肠黏膜扩大重建原位新膀胱方面取得初步成效,克服了肠代膀胱术后与肠黏膜分泌、吸收相关的并发症,但对于是否可以在临床应用,还需要更加深入的研究与探讨.

2020

2021/07/20

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壳聚糖管状支架联合肌瓣原位重建颈部整段食管的可行性研究

目的 探讨壳聚糖管状支架联合肌瓣原位重建颈部食管整段缺损的可行性.方法 将大耳白兔(30只)制成3～5 mm食管整段缺损动物模型,缺如处置入壳聚糖管状支架,外覆颈部肌肉组织瓣包裹缝合形成肌性管道.术后观察实验兔成活率、并发症的发生情况及原因,植入后不同时间段支架降解、食管结构重建情况,钡餐透视观察食管通畅状态、有无狭窄发生及食管蠕动功能.结果 术后动物存活17只,术后第4周肌瓣组织愈合,壳聚糖管部分吸收,见炎症反应;第8周肌瓣修复良好,无纤维组织增生,壳聚糖管吸收;第16周壳聚糖管完全吸收,肌瓣内表面黏膜再生,无狭窄.钡透见食管通畅、无狭窄,蠕动弱.结论 壳聚糖管状支架联合肌瓣原位重建颈部食管整段缺损具有一定可行性,狭窄及吻合口瘘是关键问题.

2020

2021/07/20

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