盐酸去氢骆驼蓬碱对人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞凋亡及自噬的影响

目的 探讨盐酸去氢骆驼蓬碱(HMH)对人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞凋亡及自噬的影响.方法 ①SH-SY5Y细胞分别加入HMH 10,20,40,80和160μmol·L-1或DMSO(细胞对照组)孵育24 h,通过MTT实验检测SH-SY5Y细胞存活率;Hoechst33342/PI染色法观察细胞凋亡;Western印迹法检测凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2、胱天蛋白酶3、活化的胱天蛋白酶3及自噬相关蛋白微管相关蛋白轻链3B-Ⅱ(LC3B-Ⅱ)和P62的表达.②SH-SY5Y细胞分别加入HMH(2和4μmol·L-1)或DMSO孵育14 d,检测SH-SY5Y细胞克隆形成率.③HMH 40μmol·L-1单独或与3-甲基腺嘌呤(3-MA)5 mmol·L-1同时加入SH-SY5Y细胞,分别培养4或24 h后,Western印迹法检测LC3B-Ⅱ蛋白的表达.④将SH-SY5Y细胞分别加入HMH 40μmol·L-1或溶剂孵育24 h后,Western印迹法检测蛋白激酶B(Akt)、磷酸化Akt(p-Akt)、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)和p-mTOR的表达.结果 ①与细胞对照组相比,药物作用24 h后HMH 20～160μmol·L-1组细胞存活率降低(P<0.01),凋亡细胞增多,LC3B-Ⅱ蛋白的相对表达量及Bax/Bcl-2的比值增加(P<0.05,P<0.01),P62蛋白的相对表达量减少(P<0.01).HMH 40～160μmol·L-1组活化的胱天蛋白酶3/胱天蛋白酶3的比值增加(P<0.05).②与细胞对照组相比,药物作用14 d后,HMH 2和4μmol·L-1组细胞克隆形成率降低(P<0.01).③HMH与3-MA同时孵育24 h后,细胞LC3B-Ⅱ的相对表达量比HMH 40μmol·L-1单独处理组降低(P<0.05).④与细胞对照组相比,HMH 40μmol·L-1组Akt和mTOR的磷酸化水平均降低(P<0.05).结论 HMH通过抑制Akt/mTOR通路抑制人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞增殖,诱导凋亡与自噬.

2020

2021/07/20

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全身应用神经生长因子对大鼠胫骨干骨折早期愈合作用及骨形态发生蛋白2和血管内皮生长因子表达的影响

背景:骨折愈合是一种十分复杂的多阶段生理过程,由多种细胞协调参与.有关神经因素对于骨折愈合过程的影响逐渐被重视和深入研究,神经生长因子是一种能够促进细胞生长的生物活性复合蛋白,其促进骨折愈合过程中所发挥的作用机制尚不明确.目的:观察神经生长因子对大鼠胫骨骨折愈合的促进作用及愈合过程中机制.方法:将72只雄性SD大鼠随机分为模型组和神经生长因子组,构建胫骨干闭合骨折模型并应用髓内固定.神经生长因子组给予肌肉注射,注射用鼠神经生长因子;模型组给予肌肉注射生理盐水.实验于2018-05-30经福建医科大学实验动物伦理委员会批准,批准号:FJYKDX-2018-035.结果 与结论:①干预2周和4周时,神经生长因子组骨痂体积显著高于模型组,干预6周时,神经生长因子组骨折线消失,髓腔再通,骨折早于模型组达到完全愈合;②苏木精-伊红染色显示干预2周和4周时,神经生长因子组骨小梁生长致密,可见大量成骨细胞生长;③干预2周和4周时,神经生长因子组血清碱性磷酸酶含量明显高于模型组;④免疫组化结果显示,干预2周和4周时,神经生长因子组骨痂内骨形态发生蛋白2和血管内皮生长因子阳性表达均显著多于模型组;⑤定量PCR结果显示,干预2周和4周时,神经生长因子组骨形态发生蛋白2和血管内皮生长因子mRNA表达水平均高于模型组;⑥提示全身应用神经生长因子可增强大鼠胫骨骨折端成骨能力,促进骨折早期愈合;同时神经生长因子可促进骨形态发生蛋白2和血管内皮生长因子的表达,并在不同时期这种促进作用表现出一定的规律,进而诱导成骨细胞分化增殖及细胞外基质的形成和钙化,促进骨形成及骨愈合.

2020

2021/07/20

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去小胶质细胞化对糖尿病小鼠视网膜光感受器细胞的影响

目的 观察去小胶质细胞化对早期糖尿病小鼠视网膜光感受器细胞的影响.方法 选取6～8周龄的SPF级雄性C57BL/6J小鼠作为实验动物,未经处理的5只作为空白对照组(A组),10只采用链脲佐菌素(STZ)腹腔注射法成功诱导出糖尿病后的小鼠随机等分为B、C两组.A、B组继续喂养标准实验饲料4周,C组在喂养1周标准实验饲料后添加含290 mg·kg-1 PLX3397(集落刺激因子1受体拮抗剂)的AIN-76A(标准饮食配制的啮齿类实验动物纯化饲料)3周以去除小胶质细胞.4周后于同一时间点处死各组动物,眼球标本均于处死后即刻获取并固定.制备视网膜石蜡切片,HE染色后光学显微镜下观察视网膜结构;小胶质细胞特异性抗体P2ry12免疫荧光化学法检测小胶质细胞在视网膜上的分布,并测算平均吸光度(D)值以间接代表小胶质细胞的数量;TUNEL法测定光感受器细胞的凋亡情况;将上述观察指标在三组间进行比较.结果 光镜观察视网膜结构显示,与A组相比,B组神经纤维层变水肿,内丛状层、内核层及外核层排列变疏松;C组也出现上述改变,但程度较轻.小胶质细胞的免疫荧光化学检测结果显示:A组可在视网膜内层检测到少量的小胶质细胞;B组的小胶质细胞则分布于视网膜全层,提示其由内层向全层发生迁移;C组在各层均未检测到小胶质细胞.B组视网膜P2ry12的D值均较A组和C组高(t=3.478、8.166,均为P<0.05),A组也明显高于C组(t=30.409,P<0.001).光感受器细胞每高倍视野凋亡数A、B、C三组分别为(0.67±0.87)个、(9.22±1.56)个、(2.22±0.97)个,B组与A组及C组相比差异均有统计学意义(t=14.360、11.408,均为P<0.001);A组凋亡细胞数较C组少,差异均有统计学意义(t=-3.585,P=0.02).结论 在糖尿病早期小胶质细胞参与了糖尿病视网膜光感受器细胞的损害过程,通过早期对小胶质细胞进行耗竭化处理可缓解视网膜的水肿和外核层细胞的凋亡.

2020

2021/07/20

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电针对APP/PS1小鼠脑功能活动影响的功能性磁共振成像研究

目的 探讨电针百会(DU20)、神庭(DU24)对APP/PS1小鼠的脑功能活动的影响.方法 同窝4月龄APP/PS1双转基因小鼠16只随机分为模型组(n=8)和电针组(n=8);同窝转基因阴性小鼠(n=8)为对照组.电针组电针百会、神庭,共16周.干预前后进行新物体识别实验;小动物功能磁共振成像(fMRI)局部一致性(ReHo)分析法观察脑功能活动.结果 干预后,与对照组相比,模型组新物体识别指数降低(P<0.05);与模型组相比,电针组新物体识别指数增高(P<0.05).干预前,与对照组相比,模型组右侧基底前脑、左侧海马ReHo降低.干预后,与对照组相比,模型组双侧海马ReHo降低,压后皮质ReHo升高;与模型组相比,电针组双侧海马、运动皮质ReHo升高,前扣带回ReHo下降.结论 电针百会、神庭可延缓APP/PS1小鼠学习记忆功能减退,可能与调节海马区的功能活动有关.

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2021/07/20

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IVC换笼标准操作程序与小鼠病毒病原的传播风险

目的 研究独立通风笼具换笼标准操作程序与实验动物负压屏障设施内使用IVC(individual ventilated cage,IVC)设备饲养小鼠的病毒感染风险.方法 选择小鼠易感的小鼠肝炎病毒(MHV)A59株感染6周龄BALB/c雄性小鼠,按照IVC换笼标准操作程序进行换笼操作;使用IFA和ELISA血清学方法以及针对MHV的核酸检测方法测定同一笼架具相邻笼盒、同一IVC系统不同笼架具的不同位置、以及IVC系统外负压屏障设施内哨兵动物的MHV感染情况.结果 接种病毒小鼠在感染6 d后出现临床症状,粪便中可检出MHV病原;动物感染3周后可检出MHV抗体阳性;其他监测组在5周实验终点均无MHV阳性检出.结论 IVC换笼标准操作程序可指导IVC换笼操作,用以控制病毒类病原对小鼠的感染风险.

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2021/07/20

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EphB/EphrinB信号通路对成骨分化能力的影响

目的 探讨EphB/EphrinB信号通路对去势小鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow derived mesenchymal stem cells,BMSCs)的成骨分化能力和绝经后骨质疏松动物模型骨量的影响.方法 将24只8周龄健康雌性BALB/c小鼠随机分为去势组(OVX组)和假手术组(Sham组),检测小鼠BMSCs中EphB/EphrinB信号通路表达水平.②将去势小鼠分为4组,分别进行腹腔注射相应Eph受体激动剂:EfnB 1-Fc及EfnB2-Fc,Eph受体抑制剂EphB2-Fc,对照组腹腔注射human IgG-Fc.各组分别于术后10周将小鼠脱颈处死,在Micro-CT分析下比较股骨骨质情况.去势组和假手术组小鼠取股骨与胫骨骨髓,经密度梯度离心法分离培养并鉴定其骨髓间充质干细胞至P3用于实验,各组BMSCs在成骨诱导条件下7d后,通过Realtime PCR检测成骨相关基因(Runx2、ALP、Osterix)及破骨细胞分化相关基因(OPG、RANKL)的表达水平,成骨分化14、21 d后,采用ALP染色和茜素红染色观察成骨分化能力.结果 与假手术组(Sham组)相比较,去势组(OVX组)中EfnA2、EphB4、EfnB2、EfnB1及EphA4表达显著增高(P＜0.01);Sham组中EphA2及EfnB2表达显著降低(P＜0.01).10周后Micro-CT结果显示,与去势对照Fc组比较,Sham组、EfnB 1-Fc、EfnB2-Fc及EphB2-Fc去势组骨小梁结构均较完整、骨小梁密度较好(P＜0.01);与EfnB1-Fc、EfnB2-Fc去势组相比较,Sham组和EphB2-Fc去势组的骨密度及骨体积分数均明显增高(P＜0.01).Realtime PCR检测成骨相关基因提示,与去势对照Fc组比较,EfnB1-Fc、EfnB2-Fc和EphB2-Fc去势组中ALP与Osterix的表达明显升高(P＜0.01);EfnB 1-Fc和EphB2-Fc可显著提高BMSCs成骨分化中ALP的活性和骨基质矿化能力,以EphB2-Fc效果最为显著(P＜0.01).与去势对照Fc组比较,EfnB1-Fc、EfnB2-Fc和EphB2-Fc去势组中RANKL的表达未见明显差异(P＞0.05),但OPG的表达明显升高(P＜0.01),其中,EfnB1-Fc去势组与EphB2-Fc去势组中OPG/RANKL的比率升高最为明显(P＜0.01).结论 EphB2/EfnB1双向信号通路可逆转去势所导致的骨量减少,上调ALP与Osterix的表达,促进BMSCs的成骨分化能力,并可通过调节OPG/RNAKL比率影响去势骨髓间充质干细胞的功能,从而间接影响破骨细胞系的分化.

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2021/07/20

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let-7a通过抑制MAP4K3/MKK4/JNK信号通路减少脑出血大鼠神经元调亡

目的:研究微小RNA let-7a对脑出血(ICH)大鼠神经元凋亡的影响及其分子机制.方法:从48只健康SD大鼠中随机选取8只作为假手术组,将2μLⅦ型胶原酶注入其余大鼠苍白球以构建ICH模型.将造模后的大鼠随机分为模型(2μL生理盐水)组、let-7a激动剂(agomir)组、阴性对照(NC)agomir组、let-7a拮抗剂(an?tagomir)组和NC antagomir组,每组8只,在侧脑室注射相应药物.7 d后进行神经功能评分;HE染色观察病理损伤;RT-qPCR和Western blot检测相关蛋白表达水平;TUNEL染色检测神经元凋亡情况;利用生物信息学软件预测let-7a与丝裂原活化的蛋白激酶激酶激酶激酶3(MAP4K3)的靶向关系,并在HEK293T细胞中用双萤光素酶报告基因实验进一步验证.结果:动物实验中,let-7a过表达时,神经功能评分降低,病理损伤减轻,胶质细胞原纤维酸性蛋白(GFAP)低表达,神经元凋亡减少,cleaved caspase-3和cleaved PARP低表达(P<0.05).细胞实验中,MAP4K3是let-7a的靶基因之一,且两者为负向调控;let-7a过表达抑制MAP4K3/MKK4/JNK的表达.结论:let-7a通过抑制MAP4K3/MKK4/JNK信号通路,减少ICH大鼠神经元凋亡.

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2021/07/20

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乙酰异羟肟酸的舒张血管作用及其机制

目的 研究乙酰异羟肟酸(AHA)降血压和舒张胸主动脉血管的作用及其机制.方法(1)动物实验:8周龄SD雄性大鼠,ip给予AHA 50和100 mg·kg-1,每5 d给药1次,共5次.分别在给药前1 d、给药第13天和给药第26天测收缩压(SBP)和舒张压(DBP);HE染色观察大鼠胸主动脉血管组织形态变化.(2)离体实验:①累积浓度AHA(0.1,1,3,10,30和100μmol·L-1)处理大鼠离体胸主动脉内皮完整血管环,检测血管环张力.②大鼠离体胸主动脉内皮完整和去内皮血管环用去甲肾上腺素(NE,1μmol·L-1)和KCl(60 mmol·L-1)预收缩,稳定后每10 min累积加入AHA(0.1,1,3,10,30和100μmol·L-1),计算血管舒张百分比.③内皮完整血管环分为AHA组、AHA+左旋硝基精氨酸甲酯(L-NAME)组和AHA+吲哚美辛(Indo)组.L-NAME(0.1 mmol·L-1)或Indo(0.01 mmol·L-1)孵育30 min后,加NE(1μmol·L-1)预收缩,血管收缩稳定后,累积加入AHA(0.1,1,3,10,30和100μmol·L-1),计算累积浓度AHA舒张血管百分比.④内皮完整血管环分为AHA组、AHA+4-氨基吡啶(4-AP,1 mmol·L-1)、AHA+格列苯脲(Gli,0.01 mmol·L-1)、AHA+澳化四乙胺(TEA,1 mmol·L-1)和AHA+BaCl2(0.1 mmol·L-1)组.4-AP,Gli,TEA和BaCl2孵育30 min后,加NE(1μmol·L-1)预收缩,血管收缩稳定后,累积加入AHA(0.1,1,3,10,30和100μmol·L-1),计算累积浓度AHA血管舒张百分比.⑤内皮完整血管环分为AHA 1,10和100μmol·L-1组,实验组分别加入不同浓度的AHA,预孵30 min后,加入累积浓度的CaCl2(0.1,0.3,1,3和10 mmol·L-1),计算AHA各实验组血管收缩百分比.⑥内皮完整血管环分为AHA 1,10和100μmol·L-1组,实验组分别加入不同浓度的AHA,预孵30 min后加入NE(1μmol·L-1),计算AHA各实验组血管收缩张力.结果(1)动物实验:与正常对照组相比,AHA 50和100 mg·kg-1组大鼠SBP和DBP均显著降低(P<0.01);HE染色未见AHA组大鼠胸主动脉组织形态明显改变.(2)离体实验:①累积浓度AHA对静息状态的大鼠胸主动脉内皮完整血管环张力无明显影响;②累积浓度AHA对KCl预收缩的胸主动脉环张力无明显影响,而AHA可浓度依赖性地舒张NE预收缩胸主动脉环,且去内皮组舒张程度弱于内皮完整组(P<0.01);③L-NAME和Indo均可明显抑制AHA的舒血管作用(P<0.01);④钾离子通道阻滞剂TEA和BaCl2均可明显抑制AHA的舒血管作用(P<0.01),4-AP和Gli无明显影响;⑤AHA能降低NE预收缩下细胞外钙内流引起大鼠离体胸主动脉内皮完整血管环的收缩张力(P<0.01),并使氯化钙收缩作用曲线右移;⑥AHA能降低经NE预收缩、由细胞内钙释放引起的大鼠离体胸主动脉内皮完整血管环的收缩张力(P<0.01).结论AHA具有降低正常大鼠血压和舒张胸主动脉血管环的作用,其机制可能与血管内皮、钙敏感性钾通道、内向整流型钾通道及细胞内钙释放和外钙内流有关.

2020

2021/07/20

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肥大细胞在类风湿关节炎的作用

肥大细胞(MCs)在先天免疫和获得性免疫中都具有重要作用,其特点是细胞内存在颗粒,颗粒内含有预先形成的组胺、肝素等生物效应物,经激活后,这些物质能够迅速脱颗粒并释放从而参与机体反应.类风湿关节炎(RA)是一种慢性的自身免疫性疾病,其特点是炎症、滑膜增生以及细胞和体液免疫反应异常,作为一种多因素作用的疾病,RA的具体发病机制仍未阐明.近年的临床和动物实验均表明肥大细胞在RA中发挥重要作用,越来越多研究表明MCs能够分泌促炎因子,诱导炎症细胞的浸润等,加重RA症状.深入研究MCs在RA发展中的作用,将有助于进一步理解RA的病理机制,并为其新药开发提供依据.

2020

2021/07/20

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小鼠植入后胚胎体外延时培养体系的应用进展

小鼠是研究哺乳动物中一种小型的模式生物,在研究非人灵长类以及人类胚胎之前,需要先在小鼠体内确定实验能否进行再转移到高等哺乳动物.现有体系的限制使小鼠胚胎只能在体外培养至E6.5,小鼠胚胎体外延时培养体系的建立对于理解胚胎植入后的关键事件以及分子机制有着非常重要的作用,更为人胚胎的发育研究提供有效平台.单细胞测序技术的发展为小鼠胚胎体外延时培养提供了新的可能,在这里我们介绍了小鼠植入后胚胎的普通体外延时培养体系、3D培养体系、单细胞测序技术在胚胎领域的应用,以及其未来可能的发展方向.

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2021/07/20

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