基于mTOR/p-S6K1探讨加味附子理中汤干预UC大鼠肠黏膜炎症反应的效应机制

目的:探讨加味附子理中汤治疗溃疡性结肠炎(UC)模型大鼠的疗效及相关作用机制.方法:选用72只雄性SD大鼠,分为正常组,模型组,柳氮磺胺嘧啶组(0.5g·kg-1),加味附子理中汤高、中、低剂量组(23.62,11.81,5.91g·kg-1).运用2,4,6-三硝基苯磺酸(TNBS)-乙醇复合造模法复制UC大鼠模型,连续灌胃治疗2周,观察各组大鼠一般情况,大鼠麻醉后腹主动脉采血,取结肠组织.运用结肠黏膜损伤指数(CMDI)半定量评分,苏木素-伊红(HE)染色观察大鼠结肠组织病理学改变,酶联免疫吸附测定(ELISA)检测大鼠血清白细胞介素(IL)-4,IL-6,IL-10,肿瘤坏死因子-α(TNF-α)含量;免疫组化和蛋白免疫印迹法(Western blot)分别检测结肠黏膜组织哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)及磷酸化核糖体蛋白S6激酶1(p-S6K1)蛋白表达.结果:与正常组比较,模型组大鼠CMDI评分显著升高(P＜0.01),血清IL-4,IL-10含量显著下降,IL-6,TNF-α含量显著上升(P＜0.01),结肠黏膜组织mTOR,p-S6K1蛋白表达水平显著上调(P＜0.01);与模型组比较,加味附子理中汤高剂量组大鼠CMDI评分明显下降(P＜0.05),高、中剂量组大鼠血清促炎因子IL-6,TNF-α显著降低(P＜0.01),抗炎因子IL-4,IL-10明显升高(P＜0.05,P＜0.01);加味附子理中汤高剂量大鼠mTOR,p-S6K1的蛋白表达水平明显下调(P＜0.05,P＜0.01).结论:加味附子理中汤高剂量组可显著减轻UC结肠黏膜充血水肿、炎性细胞浸润、腺体扭曲、排列紊乱等病理表现,其机制可能与其下调mTOR/p-S6K1信号、调控炎症因子的分泌有关.

2020

2021/07/20

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背根神经节电穿孔转染神经元技术的改进

背景:背根神经节电穿孔技术是一种研究神经再生的高效基因转染方法,以往背根神经节电穿孔的电压条件使得标记的神经元及轴突数目较少,统计误差较高.目的:提高神经元及其轴突的标记率,为周围神经再生的研究提供理论依据.方法:以增强型绿色荧光蛋白为观察指标优化背根神经节电穿孔技术在神经元轴突再生方面的应用.将ICR小鼠随机分为2组,分别行背根神经节电穿孔手术,检测在35 V和60 V电压干预下神经元及其轴突的标记率.结果与结论:①35 V和60 V电压未造成神经元明显死亡;②与35 V电压相比,60 V电压条件下标记的神经元及其轴突数量显著增加,且通过损伤部位的轴突数量明显增多(P<0.05);③60 V电压对实验动物未造成行为功能损害;④结果表明,60 V电压能够使神经元及其轴突的标记率增高,其结果能够为周围神经元轴突再生研究提供依据.

2020

2021/07/20

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姜黄素和姜黄素联氨基抗肝癌作用比较及机制研究

目的:比较姜黄素(CUR)和其衍生物联氨基姜黄素(HZC)的体内外抗肝癌作用及机制.方法:采用MTT法检测CUR或HZC(2.5、5、10、20、40、80μmol/L)对人肝癌HepG2细胞增殖的影响;采用流式细胞术检测CUR或HZC(10、20、40μmol/L)对HepG2细胞周期分布和凋亡情况的影响;采用Western blotting法检测CUR或HZC(10、20、40μmol/L)对HepG2细胞凋亡相关蛋白表达的影响.将雄性SD大鼠随机分为正常对照组(n=10)、CUR对照组(n=10)、HZC对照组(n=10)、肝癌模型组(n=30)、CUR防护组(n=30)、HZC防护组(n=30).CUR对照组和HZC对照组大鼠分别腹腔注射CUR或HZC(剂量均为80 mg/kg);模型组、CUR防护组和HZC防护组大鼠均腹腔注射对二乙基亚硝胺(50 mg/kg)建立肝癌模型,同时2种药物防护组大鼠分别腹腔注射CUR或HZC(剂量均为80 mg/kg),每周2次,连续给药12周.给药期间,记录大鼠体质量变化和死亡情况;24周后,计算大鼠肝脏指数并观察其外观,统计肝癌结节数;采用苏木精-伊红染色法观察大鼠肝组织病理学变化并计算肝癌细胞核分裂指数;采用免疫组化法检测大鼠肝组织增殖细胞核抗原(PCNA)指数.结果:CUR和HZC均能显著升高HepG2细胞的增殖抑制率、G0/G1期细胞周期百分比和凋亡率(P<0.05);均能显著降低细胞中磷酸化蛋白酪氨酸激酶2(p-JAK2)、磷酸化信号转导及转录激活蛋白3(p-STAT3)、B淋巴细胞瘤2(Bcl-2)、Bcl-xl蛋白的表达水平,显著升高Bcl-2相关X蛋白(Bax)、细胞色素C(Cyt-c)、胱天蛋白酶9(Caspase-9)、Caspase-3、聚腺苷二磷酸核糖聚合酶(PAPR)蛋白的表达水平(P<0.05);且HZC的上述作用均显著强于CUR(P<0.05).动物实验结果显示,3个对照组大鼠无死亡,未发生肝脏癌变,肝脏外观和组织切片未见病理变化;体质量及增量、肝脏指数、癌细胞核分裂指数、肝组织PCNA指数组间比较差异均均无统计学意义(P>0.05).与肝癌模型组比较,CUR防护组和HZC防护组大鼠的存活率均显著升高,肝癌发生率和癌结节数均显著降低(P<0.05);体质量及增量均显著升高,肝脏指数、癌细胞核分裂指数、肝组织PCNA指数均显著降低(P<0.05);肝脏外观和组织切片均有一定程度病变,可见癌灶伴局灶性坏死或伴大斑片状坏死;但2种药物防护组上述指标的改善程度差异均无统计学意义(P>0.05).结论:HZC能通过抑制JAK2/STAT3信号通路和调节线粒体内源性通路的活化,发挥抑制HepG2细胞增殖、诱导其凋亡的作用,且比CUR具有更强的体外抗肝癌活性;但与CUR比较,HZC对肝癌模型大鼠各项抗肝癌指标的改善未见显著差异.

2020

2021/07/20

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电刺激肌筋膜激痛点模型大鼠局部微血管再生与血浆内皮素1及一氧化氮的表达

背景:电刺激具有促进局部组织血管再生和调节血管活性物质表达的作用,但电刺激是否能促进肌筋膜激痛点局部组织血管再生和血流状态改变尚无研究报道.目的:探讨电刺激对肌筋膜激痛点局部组织微血管再生和血浆内皮素1及一氧化氮的影响.方法:将54只SD大鼠随机分为正常对照组、模型组和电刺激组,每组18只.模型组和电刺激组采用打击联合离心运动法建立肌筋膜激痛点模型,电刺激组大鼠给予肌筋膜激痛点电刺激干预(参数:直刺2mm,电压强度6V,频率20 Hz,脉冲宽度160 ms),干预30 min/次,1次/d,干预15d.分别于干预前及干预7,15d,每个时间点每组取6只大鼠,在肌筋膜激痛点局部取材,制片后进行苏木精-伊红和免疫组织化学染色,光镜下观察其病理变化,并进行微血管密度计数分析.采用ELISA检测血浆中内皮素1及一氧化氮表达水平.实验方案中有关动物伦理问题已经南方医科大学南方医院实验动物伦理委员会讨论批准.结果 与结论:①镜下可见:造模后肌筋膜激痛点局部组织呈现虫蚀样脆性改变;经电刺激干预后局部组织微血管增加,组织结构逐渐恢复;②微血管密度计数:干预前模型组、电刺激组较正常对照组偏低;干预7,15 d电刺激组显著高于其他2组(均P＜ 0.01),电刺激组组内比较显著高于前一时间点;正常对照组和模型组各时间点组内比较差异均无显著性意义(P＞0.05);③血浆内皮素1与一氧化氮水平:干预前模型组、电刺激组内皮素1与一氧化氮水平较正常对照组高,干预15d电刺激组较前内皮素1水平降低(与0d和7d比较均P＜0.01),干预7,15d电刺激组一氧化氮水平持续增加(与前一时间点比较均P＜0.01);正常对照组和模型组各时间点组内比较差异均无显著性意义(P＞0.05);④结果表明:电刺激干预能够促进肌筋膜激痛点局部组织微血管再生,并能调节肌筋膜激痛点局部组血管活性物质的表达,改善肌筋膜激痛点局部组织缺血、缺氧状态而促进局部组织修复.

2020

2021/07/20

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三药组合抑制由α-溶血素导致的巨噬细胞炎性因子激活

为了考察一种新型三药组合(氯唑西林、硫利达嗪和四环素)对金葡菌α-溶血素分泌的影响,以及探讨该三药组合对由金葡菌α-溶血素引起巨噬细胞炎症发生的抑制作用.试验采用抗菌药物敏感实验、三维棋盘法、溶血实验、Western blot实验方法.结果 表明:三药组合显示出协同杀菌作用;三药组合能够显著协同抑制α-溶血素的分泌;三药组合可显著抑制由金葡菌α-溶血素引起巨噬细胞raw264.7相关炎症通路MAPKs、NF-κB、NLRP3蛋白的表达.说明该新型三药组合通过抑制金葡菌α-溶血素的分泌,进而阻断金葡菌α-溶血素引起的巨噬细胞炎性因子的激活.

2020

2021/07/20

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黄芩苷通过调控TGF-β1/TAK-NF-κB通路对胰腺纤维化的防治作用

目的:观察黄芩苷对慢性胰腺炎(CP)小鼠胰腺组织转化生长因子β1( TGF-β1)/TGF-β活化激酶( TAK)-核因子κB(NF-κB)信号通路的影响,探讨黄芩苷防治胰腺纤维化的作用机制.方法:健康雄性昆明小鼠58只,随机分为空白对照组、CP模型组和黄芩苷治疗组.除空白对照组外,其余小鼠均给予腹腔注射20% L-精氨酸诱发CP,治疗组于造模后2周开始腹腔注射黄芩苷(100 mg/kg,每天1次).造模后2周、4周和6周分别处死动物,下腔静脉采血,摘取小鼠胰腺组织,HE及Masson染色检测各组小鼠胰腺组织形态学改变及纤维化程度;ELISA检测血清TGF-β1的表达;免疫组织化学法观察胰腺组织纤维连接蛋白( FN)和NF-κB的表达;Western blot检测胰腺组织FN、转化生长因子βⅠ型受体(TGF-βRⅠ)、磷酸化TAK1( p-TAK1)及NF-κB蛋白的表达;real-time PCR检测胰腺组织基质金属蛋白酶1(MMP-1)及金属蛋白酶组织抑制物1(TIMP-1)的mRNA表达.结果:腹腔注射20% L-精氨酸2周、4周和6周后,HE及Masson染色显示胰腺组织有纤维沉积,FN表达升高;而黄芩苷治疗后小鼠的胰腺损伤及胶原纤维沉积程度明显减轻,FN表达减少(P＜0.01). CP模型组小鼠胰腺组织TGF-β1、TGF-βRⅠ、p-TAK1、NF-κB及TIMP-1的水平均升高,MMP-1表达降低;而黄芩苷治疗组TGF-β1、TGF-βRⅠ、p-TAK1、NF-κB及TIMP-1的水平降低,MMP-1表达升高(P＜0.01).结论:黄芩苷通过抑制TGF-β1/TAK-NF-κB信号通路的活化,调节MMP-1/TIMP-1的相对平衡,发挥抗CP小鼠胰腺纤维化的作用.

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2021/07/20

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人脐带动脉旁、静脉旁与华通氏胶间充质干细胞的血管生成能力比较及移植安全性评价

目的 探讨人脐带动脉旁、静脉旁与华通氏胶间充质干细胞的血管生成能力及其生物安全性.方法 分离培养人脐带动脉旁、静脉旁与华通氏胶间充质干细胞,流式细胞仪鉴定表面标记物,体外分化实验检测其多向分化潜能,免疫荧光法检测血管旁细胞标记物,体外成环检测三种干细胞的血管生成能力差异;三种干细胞移植入NOD-SCID小鼠检测其生物安全性.结果 三种干细胞表达间充质干细胞标记物,具有多向分化潜能,脐带动脉旁干细胞表达丰度更高的血管旁细胞标记物,且体外血管生成能力更强;三种干细胞移植后3月,小鼠主要器官无明显形态学损伤与异常.结论 人脐带动脉旁干细胞血管生成能力更强;三种干细胞移植NOD-SCID小鼠无显著成瘤性,安全可行.

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2021/07/20

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褪黑素受体激动剂Neu-p11改善T2DM大鼠的胰岛素抵抗作用研究

目的 研究褪黑素受体激动剂Neu-p11改善2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus,T2DM)大鼠的胰岛素抵(insulin resistance,IR)作用,并预测其可能机制.方法 采用长期高脂肪饲养加小剂量链脲佐菌素(STZ,30 mg·kg-1,ip)诱导雌性大鼠2型糖尿病动物模型,灌胃给药4周后处死,取肝脏组织.采用RT-PCR方法 测定大鼠Sirt1、Nrf-1/2、ERRα等相关因子的mRNA表达量;Western Blot法测定PGC-1α、Mfn2的相对表达.测定大鼠INS,计算HOME-IR与ISI.测定大鼠肝脏ATP含量及ATP酶活力.结果 与正常组相比,T2DM大鼠发生IR,PGC-1α、Mfn2蛋白表达上调,Sirt1等mRNA表达显著降低,ERRαmRNA表达升高,ATP含量显著减少,ATP酶活力减弱.与模型组相比,Neu-p11低剂量组降低T2DM大鼠INS;改善T2DM大鼠IR;上调大鼠肝脏蛋白和mRNA表达,下调ERRαmRNA的表达,增加大鼠肝脏ATP含量与ATP酶活力.结论 褪黑素受体激动剂Neu-p11可能以调节T2DM大鼠肝脏线粒体平衡相关因子,维持线粒体功能正常为机制,改善IR.

2020

2021/07/20

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基于PI3K/Akt/mTOR信号通路探讨炙甘草汤抗大鼠MIRI致室速和室颤的作用机制

目的:通过磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信号通路,探讨炙甘草汤干预心肌缺血再灌注损伤(MIRI)致心律失常(室速和室颤)的作用及其机制.方法:将72只SD大鼠随机分为假手术组,模型组,炙甘草汤低、中、高剂量组(11.43,22.86,45.72 g·kg-1),稳心颗粒组(2.43 g·kg-1),连续给药干预10d.末次给药2h,采用结扎冠状动脉左前降支法制备大鼠MIRI模型,记录心电图的变化.造模成功后采集血液及心脏组织,检测血清中肌酸肌酶(CK),乳酸脱氢酶(LDH)及丙氨酸氨基转移酶(AST)的含量;酶联免疫吸附测定(ELISA)检测心肌肌钙蛋白(CtnI)的含量;免疫组化法检测心肌PI3K,Akt,mTOR的表达;采用蛋白免疫印迹法(Western blot)检测心肌自噬相关蛋白微管相关蛋白1轻链3(LC-3),自噬标志物Beclin1和PI3K/Akt/mTOR信号通路相关蛋白表达及磷酸化p-PI3K,p-Akt,p-mTOR的水平.结果:模型组大鼠100％发生室速,91.67％发生室颤;与假手术组比较,模型组大鼠血清CK,LDH,AST以及CtnI的含量显著升高(P＜0.01),心肌组织中PI3K,Akt,mTOR表达显著升高(P＜0.01),LC3-Ⅱ/LC3-I与Beclin1的相对表达量显著升高(P＜0.01),p-PI3K/PI3K,p-Akt/Akt,p-mTOR/mTOR显著降低(P＜0.01);与模型组比较,炙甘草汤高剂量组室速、室颤发生率显著降低(P＜0.01),较其他给药组持续时间短(P＜0.01);炙甘草汤高剂量组CK,LDH,AST水平及CtnI含量显著降低(P＜0.01);炙甘草汤给药组的PI3K,Akt,mTOR的表达随剂量的增加而显著降低(P＜0.01);LC-3,Beclin1的表达随炙甘草汤各剂量组的增加有不同程度地下降(P＜0.01),而PI3K/Akt/mTOR相关蛋白表达比值明显升高(P＜0.05,P＜0.01).结论:炙甘草汤预处理能使异常升高的心肌酶CK,LDH,AST,CtnI降低,抑制细胞的过度自噬,上调PI3K,Akt和mTOR的表达,说明炙甘草汤抗MIRI致心律失常的作用可能与PI3K/Akt/mTOR信号通路有关.

2020

2021/07/20

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通过矿化提高蛋白疫苗稳定性的研究

目的:通过原位矿化的方式制备肺炎链球菌蛋白质的磷酸钙矿化颗粒,并评价其在蛋白酶和热处理后的稳定性.方法:通过分子克隆技术表达并纯化蛋白野生型溶血素(WT-PLY)和其无溶血活性突变体(ΔA146PLY),在富含Ca2+和PO43-的弱碱性溶液(pH=7.5)中进行生物矿化,制备磷酸钙矿化的蛋白颗粒;通过TEM、FESEM、EDS等分析矿化颗粒的大小、形貌及表面成分;通过抗蛋白酶K降解实验、溶血实验等分析矿化疫苗的稳定性;通过体外细胞实验和体内动物实验评估热处理后矿化蛋白疫苗的保护效应.结果:在1 ml矿化体系中含有360μg蛋白、8.8μmol Ca2+、8.8μmol Mg2+和5.28μmol PO43-的条件下,均可制备出WT-PLY和ΔA146PLY的矿化颗粒,BCA检测其包封率分别为44.4％和52.2％;矿化颗粒WT-PLY@CaP和ΔA146PLY@CaP在蛋白酶K处理15 min内其抗酶解活性高于其可溶性蛋白;矿化颗粒WT-PLY@CaP在55℃处理5 min和45℃处理60 min后,其溶血活性较其可溶性蛋白高;矿化颗粒ΔA146PLY@CaP在55℃处理5 min和45℃处理60 min后仍保持与未处理蛋白一致的免疫活性.结论:生物矿化有助于提高蛋白稳定性.这为疫苗蛋白及其他蛋白制品稳定性的提高提供了一种简便易行的矿化方法.

2020

2021/07/20

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