一株草鱼维氏气单胞菌的分离鉴定及毒力基因分析

为了鉴定贵州芩巩县某养殖场草鱼发病死亡的病原,本研究通过临床解剖观察、细菌分离培养、革兰氏染色镜检、生化鉴定、药敏试验、动物回归试验、16S rDNA与 gyr B基因测序及系统分析进行鉴定.结果显示,本研究从发病草鱼体内分离到1株致病菌GZQG2019,分离菌在培养基中呈圆形、表面湿润光滑、边缘整齐半透明的灰白色菌落,菌落周围呈现β-溶血环;革兰氏镜检显示,分离菌呈两端钝圆短小阴性杆菌;16S rDNA 、gyr B基因序列分析显示,分离菌与维氏气单胞菌聚为一支,同源性均在99％以上;药敏试验结果显示,在使用的20种抗菌药物中,该菌对四环素、丁胺卡那、多黏菌素B和头孢曲松等10种药物敏感,对苯唑西林、青霉素、阿莫西林和庆大霉素等8种药物中度敏感,对头孢氨苄、复方新诺明2种药物耐药;动物回归试验显示,该菌对健康草鱼具有强致病性;10种毒力基因扩增结果显示,分离菌携带气溶素、热不稳定性肠毒素、溶血素、核酶、丝氨酸蛋白酶、弹性蛋白酶和酯酶7种毒力基因.本试验成功分离到1株草鱼源维氏气单胞菌,具有较强毒力,且携带多种毒力因子;对四环素、丁胺卡那等药物敏感,对四环素、丁胺卡那等耐药,为维氏气单胞菌病临床用药提供参考依据.

2020

2021/07/20

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二甲双胍改善糖尿病模型大鼠腰椎与后肢骨强度作用的差异

背景:研究证实二甲双胍对骨代谢有一定的调节作用,但其对骨强度的作用研究在国内仍未报道.目的:观察二甲双胍改善糖尿病大鼠腰椎、后肢骨强度的作用差异.方法:实验方案经广州中医药大学第一附属医院动物实验伦理委员会批准.30只大鼠随机挑选6只为空白组,24只大鼠6周高糖高脂饮食后,给予链脲佐菌素(40 mg/kg)一次性腹腔注射建立2型糖尿病大鼠模型,从中挑选造模成功12只分为模型组及二甲双胍组.二甲双胍组300 mg/(kg?d)二甲双胍悬浊液2 mL灌胃,1次/d;空白组和模型组用0.9％氯化钠溶液2 mL灌胃,1次/d;各组均给药12周.分别于给药后8,12周检测各组大鼠腰椎、股骨及胫骨最大载荷及弹性模量,计算给药12周时二甲双胍对中轴骨及外周骨的最大载荷改善率.结果与结论:①二甲双胍组给药8,12周后对胫骨最大载荷均升高,给药12周后对腰椎、股骨最大载荷亦升高(P<0.05);②给药12周后,二甲双胍组腰椎及胫骨弹性模量均高于模型组(P<0.05);③给药12周后,二甲双胍组腰椎最大载荷改善率为38.35％,股骨最大载荷改善率为24.05％,胫骨最大载荷改善率为14.70％;④结果说明,二甲双胍对糖尿病大鼠腰椎、后肢的骨强度均有一定改善作用,且对中轴骨(腰椎)的骨强度改善作用可能优于外周骨(股骨、胫骨).

2020

2021/07/20

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肿瘤类器官模型的建立及应用

来源于特异性干细胞,经体外三维培养,形成与原器官相类似的空间形态结构,称为类器官(organoid).运用该培养技术形成的肿瘤类器官,可以较好地再现原发肿瘤的体内特征及异质性,而且所需形成时间短、传代稳定,弥补了传统肿瘤模型的缺陷,可用于肿瘤的发生和发展机制研究、药物筛选与个体化治疗、免疫治疗和液体活检等.本文将从肿瘤类器官模型的发展简史、建立方法、应用前景及局限性等方面进行综述.

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2021/07/20

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血液制品中病毒检测控制与风险管理

20世纪80年代以来,发生多起经血液传播的病毒感染,血液制品病毒安全性倍受关注.目前我国已发布多部法规、条例以及指导原则对血液制品病毒安全性进行严格管理.本文分析了我国管理法规中关于病毒安全管理的相关要求,对血浆及其制品的病毒检测方法,生产工艺中病毒灭活/去除的相关方法及其验证进行了阐述,旨在推动血液制品中病毒风险控制与管理水平的提高及血液制品的合理应用.

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2021/07/20

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缝隙连接蛋白43在骨关节炎软骨及细胞中表达及shRNA慢病毒载体的构建

背景:缝隙连接蛋白43在骨关节炎的发生发展中具有重要作用,但具体机制尚不明确.目的:通过体内和体外实验检测缝隙连接蛋白43在骨关节炎软骨和细胞中的表达,验证骨关节炎软骨及软骨细胞(SW1353)中缝隙连接蛋白在连接蛋白家族的主导地位;构建缝隙连接蛋白基因的shRNA慢病毒载体,建立SW 1353细胞的稳定转染细胞株.方法:C57BL/6小鼠6只,通过前交叉韧带横切术建立小鼠骨关节炎动物模型,通过免疫组织化学染色检测骨关节炎与正常关节中缝隙连接蛋白表达水平的差异.采用RT-PCR技术检测SW 1353细胞中缝隙连接蛋白43 mRNA的表达,同时检测SW1353细胞中缝隙连接蛋白37、40、45和46基因的表达水平作为对照.将缝隙连接蛋白43 mRNA连接到含有增强型绿色荧光蛋白基因的慢病毒载体中,重组获得慢病毒质粒,将其与辅助包装质粒共转染293T细胞.所获慢病毒载体感染SW1353细胞后,检测缝隙连接蛋白43的表达.实验方案经口腔疾病研究国家重点实验室伦理委员会批准(批准号为SKLODLL2013A172).结果 与结论:①缝隙连接蛋白43在小鼠骨关节炎软骨组织中的表达较健康关节明显增加;②缝隙连接蛋白43 mRNA在SW 1353细胞中的表达明显高于缝隙连接蛋白37、40、45和46的基因表达,SW 1353细胞中的缝隙连接蛋白43在连接蛋白家族中具有主导地位;③缝隙连接蛋白43 shRNA慢病毒载体可抑制SW 1353细胞中缝隙连接蛋白43 mRNA的表达;④实验筛选出稳定转染的SW 1353细胞株,为验证缝隙连接蛋白43在骨关节炎中的作用机制奠定了基础.

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2021/07/20

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N-乙酰半胱氨酸对顺铂导致肾毒性的保护作用及作用机制分析

目的:通过动物实验分析探讨N-乙酰半胱氨酸对于顺铂诱导的肾毒性和肾损伤的保护功能及其机制,为临床药理研究提供参考.方法:选取60只BALB/c小鼠,雌雄各半,喂养7 d后腹腔注射20 mg/kg的顺铂,持续注射3 d诱导并建立急性肾损伤小鼠模型(AKI),后随机分为6组,A组给予5 mg/kg顺铂,B组给予250μg/(100 g·d)的N-乙酰半胱氨酸,C组给予5 mg/kg顺铂+250μg/(100 g·d)的N-乙酰半胱氨酸;D组给予500μg/(100 g·d)的N-乙酰半胱氨酸;E组给予5 mg/kg顺铂+500μg/(100 g·d)的N-乙酰半胱氨酸,F组注射生理盐水做对照,连续治疗7 d后,抽取小鼠眼球血,测定生化指标、炎症因子水平;做肾脏病理切片图评价肾损伤水平,并加以比较.结果:在给药前,6组小鼠的血肌酐(Scr)、尿素氮(BUN)、肾损伤评分(RIS)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、谷胱甘肽(GSH)水平比较差异无统计学意义(P>0.05);给药后,6组上述指标差异有统计学意义(P<0.05):①血清Scr、BUN、TNF-α和肾损伤评分RIS:A组>F组>C组>E组>B组>D组,与治疗前相比,A组显著增加(P<0.05);B组、D组、E组显著降低(P<0.05),C组、F组差异无统计学意义(P>0.05);②血清GSH:A组<F组<C组<E组<B组<D组,与治疗前相比,A组显著降低(P<0.05);B组、D组、E组显著增加(P<0.05),C组、F组差异无统计学意义(P>0.05).结论:N-乙酰半胱氨酸可减轻因顺铂导致的小鼠肾毒性和肾损伤程度,对肾脏具有保护作用,且动物实验的疗效与N-乙酰半胱氨酸的剂量有高度相关性,其机制则与N-乙酰半胱氨酸具有抑制炎症反应和肾组织细胞凋亡、抗氧化应激等药理作用有关.

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2021/07/20

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一种快速定量检测猴组织中SIV/SHIV的方法

目的 以猴-人免疫缺陷病毒(simian-human immunodeficiency virus,SHIV)gag基因为特异性扩增靶标,建立一种快速、灵敏、特异的TaqMan实时荧光定量PCR法检测猴血浆、外周血单核细胞和淋巴结中的猴免疫缺陷病毒(simian immunodeficiency virus,SIV)和SHIV.方法 以SHIVSF162p3n gag基因为模板,用普通PCR方法扩增出109 bp DNA片段用于克隆构建标准品质粒pGEM?-T-SHIV gag.通过对SHIV标准品质粒定量分析,优化反应体系,检测TaqMan实时荧光定量PCR方法的灵敏度、特异度和重复性.结果 TaqMan实时荧光定量PCR法能有效地检测出102～107 copies/μL SIV/SHIV gag基因mRNA,线性系数为R2=0.998,slop=-3.304.方法重复性检测显示CV％在0.6％～1.1％之间.结论 该TaqMan实时荧光定量PCR法具有快速、灵敏和特异性高的优点,适用于SIV/SHIV感染猴动物模型的研究工作.

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2021/07/20

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依降钙素干预膝骨关节炎模型大鼠软骨下骨的变化

背景:骨关节炎存在软骨下骨吸收和骨形成失去平衡,课题组前期研究发现膝骨关节炎大鼠关节软骨改变前软骨下骨就已经发生改变.目的:通过观察膝骨关节炎大鼠膝关节软骨下骨的变化,探讨依降钙素对软骨下骨p38 MAPK表达及软骨下骨吸收的影响.方法:雌性3月龄SD大鼠随机分为3组:假手术组(n=6)不切除卵巢,切除同卵巢等体积大小的脂肪组织,切开双侧膝关节,但不损伤交叉韧带;模型组(n=6)切除双侧卵巢后,再切断双侧膝关节前交叉韧带,建立卵巢切除+前交叉韧带切断模型,不进行药物干预;依降钙素组(n=6)建立卵巢切除+前交叉韧带切断模型后,依降钙素5 IU/kg,每周2次肌肉注射.12周后分析软骨下骨的骨密度、软骨下骨p38蛋白表达水平以及血清Ⅰ型胶原交联C-末端肽、Ⅱ型胶原交联C-末端肽、白细胞介素1、白细胞介素6、骨特异性碱性磷酸酶、抗酒石酸酸性磷酸酶5b水平.实验方案经南华大学动物实验伦理委员会批准.结果与结论:①依降钙素组软骨下骨的骨体积分数、骨小梁数量显著高于模型组(P<0.05),骨小梁分离度显著低于模型组(P<0.05);②模型组的骨体积分数、骨小梁数量、骨小梁厚度显著低于假手术组(P<0.01或<0.05)、骨小梁分离度显著高于假手术组(P<0.01);③依降钙素组血清Ⅰ型胶原交联C-末端肽、白细胞介素1、白细胞介素6、抗酒石酸酸性磷酸酶5b显著低于模型组(P<0.05),模型组Ⅰ型胶原交联C-末端肽、Ⅱ型胶原交联C-末端肽、白细胞介素1、白细胞介素6、抗酒石酸酸性磷酸酶5b明显高于假手术组(P<0.05);④软骨下骨p38蛋白表达水平依降钙素组显著低于模型组(P<0.01)、模型组显著高于假手术组(P<0.01);⑤结果说明,依降钙素可能通过下调p38 MAPK表达,抑制骨关节炎促炎因子分泌及软骨下骨吸收.

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2021/07/20

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微酸性次氯酸液对屏障设施动态环境杀菌效果的研究

目的 研究微酸性次氯酸液对细菌的杀灭效果,评估其雾化液对屏障设施动态环境的消毒效果,以期获得动态环境消毒方案.方法 检测微酸性次氯酸液有效氯含量和pH值;分别用金黄色葡萄球菌和沙门菌标准株制备细菌悬液并制成菌片,并与微酸性次氯酸液作用后计算杀菌率;选择屏障设施进行微酸性次氯酸液喷雾消毒,作用不同时间后测量落下菌数,并计算杀菌率.结果 微酸性次氯酸液有效氯含量为6.84×10-2 g/L,pH值为6.24;微酸性次氯酸液与两种标准菌株作用15 min后杀菌率可达到90％以上;屏障设施用微酸性次氯酸液喷雾15 min,2 h内杀菌率维持在90％,48～72 h杀菌率低于30％;每日喷雾1次,工作5 min,休息5 min,持续1 h,连续工作21 d后杀菌率为60％;每日喷雾2次,每次连续30 min持续喷雾21 d后杀菌率达到90％以上.结论 微酸性次氯酸液对屏障设施具有良好的杀菌效果,长期使用杀菌率可达90％以上,是一种高效安全的动态环境消毒方式.

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2021/07/20

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利用CRISP R/Cas9系统构建HMGA2敲除肝癌细胞株及其功能鉴定

目的 采用CRISPR/Cas9系统敲除肝癌细胞系HepG2的高迁移率蛋白A2(HMGA2)基因,探讨HMGA2敲除对于肝癌细胞生长、增殖、迁移以及侵袭的影响.方法 根据GenBank数据库搜索人HMGA2序列,利用在线sgRNA设计软件针对HMGA2的第一外显子以及第二外显子各设计一条sgRNA,构建靶向HMGA2的sgRNA重组敲除载体sgE1和sgE2,将sgRNA载体转染细胞,通过有限稀释法筛选得到HMGA2-/-细胞株.通过CCK8实验以及平板克隆形成实验检测HMGA2敲除对于HepG2细胞生长以及克隆形成能力的影响;采用Transwell实验检测HMGA2敲除对于HepG2细胞迁移与侵袭的影响.结果 相比于野生型,HMGA2-/-细胞株的生长速率减慢,克隆形成能力(121.83±21.68 vs 59.50±20.68,P<0.01)、迁移(359.67±32.53 vs 245.61±24.23,P<0.05)与侵袭(251.33±43.43 vs 47.00±10.00,P<0.01)能力显著下降.结论 HMGA2敲除降低了肝癌细胞HepG2的体外生存能力以及转移能力,HMGA2基因可以作为一个肝癌治疗的潜在靶点.

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2021/07/20

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