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目的 探讨乙型脑炎病毒NS3蛋白对病毒增殖及毒力的影响. 方法 利用感染性克隆技术构建以乙脑病毒疫苗株为骨架,用野毒株NS3替换疫苗株相应区域的病毒感染性克隆,体外转录获得RNA,再通过电转染BHK-21细胞拯救病毒,通过噬斑试验、免疫荧光试验和测序鉴定病毒,通过生长曲线、CCK-8检测和动物试验观察和评价嵌合病毒的增殖能力和神经毒力. 结果 酶切和测序表明JEV(V)/NS3(W)嵌合病毒感染性克隆构建成功,并经病毒测序和免疫荧光试验证实成功拯救病毒;蚀斑实验显示:嵌合病毒蚀斑直径(2.92±0.08)mm大于JEV SA14-14-2疫苗株蚀斑直径(1.90±0.10)mm(P＜0.01),与野毒株SA14噬斑直径(2.96±0.13)相似(P＞0.05);生长曲线显示,用M.O.I=0.01接种BHK21细胞后,嵌合病毒48 h达到滴度高峰(8.9 log10PFU/mL);接种BHK21细胞72 h后,CCK 8显示:嵌合病毒组细胞的增殖活性(24.9±1.3)％低于疫苗组(41.4±1.8)％ (P ＜0.01),高于野毒株组(17.7±0.5)％(P＜0.01),但动物试验显示嵌合病毒神经毒力(LD50=124.5 PFU/0.02 ml))弱于疫苗株(LD50-7.7 PFU/0.02 ml).结论 乙脑病毒NS3蛋白对病毒的增殖和毒力均有一定影响,但体内和体外实验结果存在差异. |
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