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目的:通过原位矿化的方式制备肺炎链球菌蛋白质的磷酸钙矿化颗粒,并评价其在蛋白酶和热处理后的稳定性.方法:通过分子克隆技术表达并纯化蛋白野生型溶血素(WT-PLY)和其无溶血活性突变体(ΔA146PLY),在富含Ca2+和PO43-的弱碱性溶液(pH=7.5)中进行生物矿化,制备磷酸钙矿化的蛋白颗粒;通过TEM、FESEM、EDS等分析矿化颗粒的大小、形貌及表面成分;通过抗蛋白酶K降解实验、溶血实验等分析矿化疫苗的稳定性;通过体外细胞实验和体内动物实验评估热处理后矿化蛋白疫苗的保护效应.结果:在1 ml矿化体系中含有360μg蛋白、8.8μmol Ca2+、8.8μmol Mg2+和5.28μmol PO43-的条件下,均可制备出WT-PLY和ΔA146PLY的矿化颗粒,BCA检测其包封率分别为44.4％和52.2％;矿化颗粒WT-PLY@CaP和ΔA146PLY@CaP在蛋白酶K处理15 min内其抗酶解活性高于其可溶性蛋白;矿化颗粒WT-PLY@CaP在55℃处理5 min和45℃处理60 min后,其溶血活性较其可溶性蛋白高;矿化颗粒ΔA146PLY@CaP在55℃处理5 min和45℃处理60 min后仍保持与未处理蛋白一致的免疫活性.结论:生物矿化有助于提高蛋白稳定性.这为疫苗蛋白及其他蛋白制品稳定性的提高提供了一种简便易行的矿化方法. |
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