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目的 筛选并验证RAW264.7细胞中电穿孔转染TRIB3过表达质粒和TRIB3 siRNA的条件,建立适用于RAW264.7细胞的最佳电穿孔转染方案.方法 通过改变脉冲电压、脉冲时长和质粒浓度等条件,将载体为pCMV6-Entry的TRIB3过表达质粒和TRIB3 siRNA转入RAW264.7细胞,24 h后相差显微镜观察细胞形态,CCK-8法检测细胞存活率,72 h后Western Blot法检测TRIB3蛋白表达以验证目的基因表达改变情况.结果 (1)以不同脉冲电压转染时,110和120 mV组细胞形态和存活率与对照组无差异,130和140 mV组悬浮细胞较多、细胞存活率显著低于对照组(P<0.01),120、130和140 mV组TRIB3蛋白表达显著增加(P<0.05);(2)以不同脉冲时长进行转染时,10和20 ms组细胞形态和存活率与对照组无差异,30 ms组细胞存活率显著低于对照组(P<0.01),20和30 ms组TRIB3蛋白表达显著增加(P<0.01);(3)以不同质粒浓度进行转染时,2和4μg组细胞形态和存活率与对照组无差异,6μg组细胞存活率低于对照组(P<0.05),4μg组TRIB3表达显著增加(P<0.01);(4)以120 mV、20 ms条件转染不同浓度TRIB3 siRNA时,各组细胞形态和存活率均与对照组无差异,10 nmol/L组TRIB3表达仅为对照组的0.19倍(P<0.01).结论 以120 mV、20 ms条件在RAW264.7细胞中电穿孔转染TRIB3过表达质粒(每样本4μg)和TRIB3 siRNA(10 nmol/L),在保证较高的细胞存活率的同时能显著改变目的基因的蛋白表达水平,为后续RAW264.7细胞中质粒转染相关的基础研究提供实验依据和借鉴. |
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