| 中文摘要Abstract in Chinese |
[目的]探讨泛素结合酶E2T(UBE2T)在布鲁氏菌感染过程中的功能.[方法]构建UBE2T基因过表达载体pLVX-puro-UBE2T,对其进行PCR和EcoR Ⅰ/BamH Ⅰ双酶切验证,并将其转染小鼠巨噬细胞RAW264.7,利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测UBE2T基因过表达效果.设计并合成3条UBE2T基因沉默表达的siRNA(UBE2T-379-siRNA、UBE2T-599-siRNA和UBE2T-661-siRNA),将其转染小鼠巨噬细胞RAW264.7,利用qRT-PCR检测UBE2T基因沉默表达效果.采用四甲基偶氮唑盐(MTT)试验,检测UBE2T沉默或过表达对RAW264.7细胞活性的影响.利用qRT-PCR,检测M5-90感染对RAW264.7细胞UBE2T基因相对表达量的影响,以及对过表达或沉默表达UBE2T基因的RAW264.7细胞中含pyrin结构域NOD样受体家族3(NLRP3)和半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶1(Caspase-1)基因相对表达量的影响.用布鲁氏菌M5-90菌株感染过表达和沉默UBE2T基因的RAW264.7细胞,用活菌计数法检测UBE2T沉默或过表达对RAW264.7细胞内布鲁氏菌增殖的影响,利用相应的试剂盒检测细胞乳酸脱氢酶(LDH)水平、半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶3(Caspase-3)活性及白细胞介素6(IL-6)、IL-18、IL-1β和γ-干扰素(IFN-γ)等细胞因子的水平.[结果]成功构建了UBE2T基因过表达载体pLVX-puro-UBE2T,过表达效果良好.3条siRNA中,UBE2T-661-siRNA的干扰效果最佳,其对UBE2T基因的沉默效率为84％.UBE2T沉默或过表达对RAW264.7细胞活性无影响.M5-90感染可提高RAW264.7细胞UBE2T的表达量;沉默UBE2T可提高M5-90介导的NLRP3和Caspase-1的表达,而过表达UBE2T会抑制M5-90介导的NLRP3表达,提高M5-90介导的Caspase-1表达.沉默表达UBE2T可抑制胞内M5-90的增殖,而过表达UBE2T可促进胞内M5-90的增殖.沉默表达UBE2T可抑制M5-90介导的LDH水平,提高Cas pase-3活性及IFN-γ、IL-6和IL-1β水平;而过表达UBE2T可提高M5-90介导的LDH水平,抑制Caspase-3的活性及IFN-γ、IL-1β水平.[结论]泛素结合酶UBE2T对胞内布鲁氏菌增殖具有正调控作用. |
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